Die Wechselwirkungen von monomeren Acridinen und unsymmetrischen Bisacridinen (UAs) mit DNA-Duplexen: eine Erkenntnis aus NMR- und MD-Studien

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 3431 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Mitglieder einer neuen Klasse von Antikrebsverbindungen mit hoher Antitumoraktivität, die unsymmetrischen Bisacridine (UAs), bestehen aus zwei heteroaromatischen Ringsystemen. Eines der Ringsysteme ist eine Imidazoacridinon-Einheit, deren Gerüst mit der Strukturbasis von Symadex identisch ist. Die zweite ist eine 1-Nitroacridin-Einheit und kann daher als strukturelle Basis von Nitracrine angesehen werden. Diese Monoacridin-Einheiten sind durch einen Aminoalkyl-Linker verbunden, der in seiner Struktur variieren kann. Theoretisch sollten diese unsymmetrischen Dimere als Bisinterkalatoren für doppelsträngige DNA (dsDNA) fungieren, da zuvor berichtet wurde, dass die Monomereinheiten, aus denen die UAs bestehen, einen interkalierenden Bindungsmodus in dsDNA aufweisen. Im Gegenteil, unsere früheren Vorstudien deuten darauf hin, dass eine spezifische und/oder strukturell wohldefinierte Bindung von UAs an DNA-Duplexe möglicherweise nicht der Fall ist. In diesem Beitrag haben wir die dsDNA-Bindungseigenschaften der Monoacridine C-1305, C-1311 (Symadex), C-283 (Ledakrin/Nitracrine) und C-1748 sowie der Bisacridine C-2028, C erneut untersucht und sorgfältig untersucht -2041, C-2045 und C-2053 unter Verwendung fortschrittlicher NMR-Techniken, unterstützt durch molekulare Modellierungsrechnungen und die Analyse von UV-VIS-Spektren, zerlegt durch chemometrische Techniken. Mithilfe dieser Studien konnten wir erklären, warum die Eigenschaften von UAs nicht einfach die Summe der Merkmale der Acridinmonomere sind.

Eine neue Klasse von Antikrebsmitteln, nämlich unsymmetrische Bisacridine (UAs), wurde kürzlich synthetisiert und zahlreichen Studien unterzogen1. Sie zeigten eine hohe Antitumoraktivität gegen über ein Dutzend getestete Krebszelllinien sowie Antitumoraktivität gegen Walker-256-Ratten-Adenokarzinom und zehn menschliche Tumor-Xenotransplantate in Nacktmäusen. Bemerkenswerterweise hemmten die Verbindungen mit der höchsten Aktivität die Zelllinien von Bauchspeicheldrüsenkrebs stark1. Studien zu den biologischen Wirkungen dieser Verbindungen zeigten ihre Fähigkeit, das Wachstum von 3D-Krebssphäroiden zu unterdrücken2. Darüber hinaus wurde ihre Antikrebsaktivität durch die Bindung an quartäre Quantenpunkte verstärkt, was zu einer selektiven Hochregulierung ihrer zellulären Aufnahme führte3.

Die molekularen Grundlagen der biologischen Aktivität von UAs sowie ihre potenziellen molekularen Ziele werden noch umfassend erforscht. Soweit wir wissen, handelt es sich bei UAs um hochzytotoxische Verbindungen mit IC50-Werten im ng/ml-Bereich, obwohl die Empfindlichkeit einzelner Zelllinien gegenüber den Verbindungen unterschiedlich ist. Frühere Ergebnisse zeigten, dass mit UAs behandelte Zellen Apoptose oder Seneszenz durchlaufen4. Es wurde gezeigt, dass UAs schnell in die Zelle gelangen, da sie bereits 1 Stunde nach der Behandlung in den Zellen nachgewiesen werden3 (einige Ergebnisse unveröffentlicht). Allerdings ist der Grad, in dem UAs nach ihrem Eintritt in der Zelle zurückgehalten werden, bei verschiedenen Zelllinien deutlich unterschiedlich. Die zeitabhängige Bestimmung der UA-Konzentration nach längerer Inkubation zeigt entweder eine erhöhte, verringerte oder konstante Konzentration von UAs in Zellen3. Darüber hinaus wurde eine pH-abhängige Lokalisierung von UAs in der Zelle beobachtet, da die UA-Konzentration in Organellen mit niedrigem pH-Wert, wie Lysosomen und Endosomen, erhöht war3,5.

Mitglieder der UA-Gruppe haben ein gemeinsames Strukturmerkmal: Sie bestehen aus zwei heteroaromatischen Ringsystemen, bei denen es sich im Wesentlichen um Acridinderivate handelt. Eines der Ringsysteme ist eine Imidazoacridinon-Einheit, deren Gerüst mit der Strukturbasis von C-1311 (Symadex)1,6 identisch ist. Die zweite ist eine 1-Nitroacridin-Einheit, optional mit einem Methylsubstituenten in para-Position in Bezug auf die NO2-Funktion. Daher kann davon ausgegangen werden, dass es eine strukturelle Basis von C-283 (Ledakrin/Nitracrine) oder C-1748 hat. Diese Monoacridin-Einheiten sind durch einen Aminoalkyl-Linker verbunden, der in seiner Struktur unterschiedlich ist (Abb. 1). Da die UA-Moleküle zahlreiche potenzielle Protonierungsstellen enthalten, könnten die physikalisch-chemischen Eigenschaften und die daraus resultierende Antitumoraktivität dieser Verbindungen stark vom pH-Wert der Umgebung abhängen, was in unserem vorherigen Bericht eindeutig nachgewiesen wurde6.

Die Strukturen der untersuchten Verbindungen.

Frühere Studien haben stark darauf hingewiesen, dass C-283, C-1311 (Symadex) und C-1748 die doppelsträngigen (ds) DNA-Interkalatoren sind7,8,9,10,11,12. Kürzlich haben wir berichtet, dass Symadex ein effizienter dsDNA-Interkalator ist, der AG/CT- oder GA/TC-Dinukleotidschritte bevorzugt11,12. Die folgenden Studien zu seinem Analogon, Triazoloacridinon C-1305, haben gezeigt, dass die letztgenannte Verbindung eine bemerkenswerte Sequenzspezifität aufwies, wobei der TA/TA-Dinukleotidschritt die bevorzugte Bindungsstelle innerhalb doppelsträngiger DNA ist13. Basierend auf diesen Ergebnissen und anderen neueren Erkenntnissen14,15,16 haben wir auch vorgeschlagen, dass die TA/TA-Sequenz als bevorzugte Bindungsstelle für viele DNA-Interkalatoren fungieren könnte, zumindest für die Acridin-basierten und diejenigen, die dies nicht tun spezifische stereochemische Anforderungen bei der Bindung an dsDNA. Der TA/TA-Bindungshohlraum wurde bei Imidazoacridinon C-1311 bisher nicht berücksichtigt, während die Bindung von C-283 und C-1748 an Nukleinsäuren nie mittels NMR-Spektroskopie untersucht wurde – weder strukturell noch hinsichtlich einer möglichen Sequenz -Spezifität dieser Medikamente.

Man könnte erwarten, dass Strukturen, die aus zwei Acridin-basierten Ringsystemen bestehen, ebenfalls ausgezeichnete dsDNA-Bindungsmittel wären. Im Gegenteil, unsere früheren Studien haben überraschenderweise gezeigt, dass unsymmetrische Bisacridine (UAs) nicht mit DNA-Duplexen interagieren1. Unter Berücksichtigung aller oben genannten Punkte haben wir in diesem Beitrag detaillierte NMR- und UV-VIS-basierte Studien zu C-1305, C-1311, C-283 und C-1748 sowie UAs vorgestellt, die an verschiedene Doppelsequenzen binden -strängige DNA. In diesem Zusammenhang bestand das Ziel unserer Studien darin, tief in die Eigenschaften der oben genannten Acridinmonomere einzutauchen, um zu diskutieren, warum die Merkmale unsymmetrischer Bisacridine weit davon entfernt sind, eine einfache Summe der Eigenschaften der Monomereinheiten zu sein.

Die palindromischen Duplexe (im Folgenden als D1 bis D9 bezeichnet), die in Gegenwart der monomeren Acridinderivate untersucht wurden, sind in Tabelle 1 dargestellt. Diese Sequenzen – kombiniert – umfassten alle 10 möglichen Dinukleotidschritte, die in doppelsträngiger DNA vorkommen, und waren identisch mit diejenigen, die für Studien zu C-130513 konzipiert sind. Die Interpretation der resultierenden 1H-NMR-Spektren basierte auf denselben Annahmen wie in unserer vorherigen Arbeit13.

Um: (1) die Tendenz von Monoacridinen zur Selbstassoziation in wässrigen Lösungen zu unterdrücken; und um (2) einen höchstmöglichen molaren Anteil einer einzelnen Spektralform eines bestimmten Liganden innerhalb der Sonde während der Wechselwirkung mit Nukleinsäuren sicherzustellen, wurden alle folgenden Studien in Cacodylatpuffer bei pH = 5,0 mit einer niedrigen NaCl-Konzentration (10 mM) durchgeführt ). Unter diesen Bedingungen behielten die untersuchten dsDNA-Palindrome (Tabelle 1) die Standard-A-DNA- (D3, D6, D717,18) oder B-DNA-Konformationen (der Rest) bei, während im Fall der untersuchten Monoacridine ihre dominante Spektralform in a Lösung war ein positiv geladenes Monomer (mit Ausnahme von C-1748, das unter diesen Bedingungen keine Ladung enthält). Bemerkenswerterweise erforderte D6 eine höhere Konzentration an NaCl (50 mM), um in einer Lösung eine Doppelhelixkonformation anzunehmen.

Unsere 1H-NMR-Bewertungen für C-1311, die teilweise in Abb. 2 dargestellt sind, haben eindeutig gezeigt, dass Symadex tatsächlich die TA/TA-Bindungsstelle gegenüber den zuvor postulierten AG/TC- und GA/CT-Dinukleotidschritten bevorzugt11,12 (Abb. 2A–F). Unter Berücksichtigung der für alle hier untersuchten Sequenzen gesammelten Daten wurde die Sequenzspezifität von C-1311 als TA/TA >> CG/CG ermittelt. Obwohl eine spezifische Interkalation von Symadex in den TG/CA-Schritt nicht auf einfache Weise beobachtet werden konnte, war das bevorzugte 5′-Pyrimidin-Purin-3′-Bindungsmuster im Fall von C-1311 wie auch bei Triazoloacridinon immer noch sichtbar C-130513. Außerdem konnten wir bei unseren Untersuchungen keine spezifische Bindung von Symadex an AG/CT- und GA/TC-Stellen beobachten. Während diese Tatsache mit der Änderung der Versuchsbedingungen im Vergleich zu unseren früheren Studien in Verbindung gebracht werden könnte11,12, schien der Hauptgrund das Vorhandensein der besseren Optionen (TA/TA oder CG/CG) zu sein, die nicht an der richtigen Stelle lagen Enden der palindromischen Sequenzen.

Beispielhafte 1H-NMR-Spektren von: freiem D2-Duplex (A); D2-Duplex interagiert mit C-1311 (B); D2-Duplex interagiert mit C-283 (C); D2-Duplex interagiert mit C-1748 (D); freies D3-Duplex (E); D3-Duplex interagiert mit C-1311 (F); freier D9-Duplex (G); D9-Duplex interagiert mit C-1311 (H); freies D4-Duplex (I); D4-Duplex interagiert mit C-283 (J); D4-Duplex interagiert mit C-1748 (K). Zur Erläuterung der Duplex-Codenamen siehe Tabelle 1. In allen Fällen betrug die Stöchiometrie der untersuchten Komplexe dsDNA/Ligand 1:1,5 mol/mol. Rote Sternchen markieren die Iminoprotonen der verbleibenden, freien dsDNA-Duplexe.

Zwei der untersuchten nichtkovalenten Addukte, d(CGATATCG)2:C-1311 (D2L) und d(CCCTAGGG)2:C-1311 (D3L), wurden für detaillierte 2D-NMR-Studien zum direkten Vergleich mit den zuvor berichteten ausgewählt d(CGATATCG)2:C-1305- und d(CCCTAGGG)2:C-1305-Komplexe. Zusätzlich wurden die Dissoziationskonstanten von C-1311 zu palindromischen NTAN-Tetranukleotidschritten (wobei N für C/G/A/T-Nukleotide steht) mithilfe von UV-VIS-Spektroskopie bewertet. Die Ergebnisse dieser Studien wurden in separaten Kapiteln diskutiert.

Die gleichen palindromischen D1–D9-Octamere wurden in Gegenwart von C-283 und C-1748 untersucht (Tabelle 1). Leider deuteten die Resonanzen der T/G-Iminoprotonen, die bei Zugabe von Nitroacridinliganden praktisch verschwanden (Abb. 2C, D, J, K), auf die unspezifischen DNA/Ligand-Wechselwirkungen hin. Während im Fall von C-1311 ein neuer, entstehender Satz von DNA-Iminoresonanzen ein Beweis für die Bildung eines Interkalationskomplexes war (Abb. 2A, B, E, F), wurde kein solches Phänomen in Gegenwart von C-1311 beobachtet -283 oder C-1748 für keines der untersuchten Duplexe. Unter Berücksichtigung der offensichtlichen Verbreiterung der Resonanzen der aromatischen H5/H6/H8-Protonen der D1–D9-Duplexe (ohne dass neue DNA-Resonanzen auftreten, was auf das Vorhandensein eines stereochemisch definierten DNA:Liganden-Addukts schließen lässt, zeigt Abb. 2C,D,I–K) und unter Berücksichtigung der Tatsache, dass – zu diesem Zeitpunkt – der TA/TA-Dinukleotidschritt als Standardbindungsstelle von Acridin-basierten Interkalatoren betrachtet werden sollte, sollte man schlussfolgern, dass die untersuchten Nitroacridine – wenn auch unspezifisch – mit interagieren DNA – sind nicht die effizientesten dsDNA-Interkalatoren, was dem aktuellen Paradigma widerspricht7,8,9,10,19,20.

Um einen tieferen Einblick in die dsDNA:Nitroacridin-Wechselwirkungen zu erhalten, haben wir zusätzlich Titrationsexperimente durchgeführt, wobei wir das d(CGATATCG)2 (D2)-Palindrom als DNA-Wirt verwendeten. Bei der Zugabe von C-283 (Nitracrin, siehe Abb. S10A in den ergänzenden Daten) wurde das dringende Verschwinden der T4- und T6-Imino-Resonanzen beobachtet, wohingegen die G2- und G8-Imino-Protonen-Resonanzen im Wesentlichen unverändert blieben, bis die DNA:C- 283 1:1 Mol/Mol-Stöchiometrie der Lösung wurde erreicht. Auch die aromatischen Protonen A3H2 und A5H2 sowie T4H6 und T6H6 weiteten sich allmählich aus; und T4CH3- und T6CH3-Resonanzen. Bemerkenswert ist, dass die übrigen Resonanzen nur geringfügig verschoben waren oder – in den meisten Fällen – unverändert blieben. Eine weitere Zugabe des Liganden – um die 1:1-Stöchiometrie zu überschreiten – führte zu einem Bild ähnlich Abb. 2C.

Da sich alle oben genannten Protonen im zentralen Bereich der D2-Helix befinden, haben die Titrationsexperimente gezeigt, dass C-283 mit D2 im Zentrum des untersuchten Octamers in der Nähe eines potenziellen TA/TA-Bindungshohlraums interagiert. Da wir jedoch kein Auftreten eines neuen Satzes von DNA-Resonanzen beobachteten, sondern nur die Verbreiterung einiger davon (während die Ligandenresonanzen selbst bis zur Entdeckung verbreitert waren), muss die Bildung (und Dissoziation) des DNA:Ligand-Komplexes auf der erfolgen schnelles bis mittleres Austauschregime auf der Zeitskala der chemischen Verschiebung. Da alle unsere bisherigen Erfahrungen mit der interkalativen Bindung von Acridinderivaten an DNA13 auf komplexe Lebensdauern innerhalb des langsamen Austauschregimes schließen lassen, interpretieren wir ein solches Ergebnis als einen Effekt einer flacheren und möglicherweise weniger räumlich definierten Art der Wechselwirkung, vermutlich mit der kleinen Furche der DNA . Es ist zu beachten, dass die interkalierende Wirkungsweise von Nitracrine nicht ausgeschlossen werden kann; Darüber hinaus lässt die scheinbare Verbreiterung der Thyminmethylresonanzen darauf schließen, dass das Interkalationsereignis möglicherweise stattfinden könnte. Dennoch ist die Stabilität der resultierenden dsDNA:C-283-Interkalationskomplexe, selbst wenn sie auftritt, um Größenordnungen geringer im Vergleich zu den Komplexen, die durch Imidazoacridinone und Triazoloacridinone, dh C-1311 und C-1305, gebildet werden.

Im Fall der D2:C-1748-Titrationsexperimente waren die T4- und T6-Iminoresonanzen am Ende deutlich abgeschwächt (aber immer noch beobachtbar und scharf), wohingegen die A3H2-, A5H2-, T4H6-, T6H6-, T4CH3- und T6CH3-Resonanzen leicht verbreitert waren (Abb. S10B). Der Rest der Resonanzen blieb unverändert. Diese Ergebnisse deuten auf einen DNA-Ligand-Wechselwirkungsmodus hin, der dem für C-283 vorgeschlagenen ähnelt, obwohl das Nitroacridin C-1748 eine weitaus weniger ausgeprägte Affinität zum D2-Palindrom aufwies.

1H-NMR-Untersuchungen haben gezeigt, dass Imidazoacridinon C-1311 (Symadex) sehr gut definierte nichtkovalente 1:1 mol/mol-Addukte mit den Palindromen d(CGATATCG)2 (D2) und d(CCCTAGGG)2 (D3) bildet (Abb. 2A,B,E,F, Tabelle 1). Da für Strukturstudien an Komplexen, die durch Triazoloacridinon C-130513 gebildet werden, dieselben Oktamere ausgewählt wurden, haben wir uns entschieden, die stereochemischen Eigenschaften der resultierenden Addukte direkt mit den zuvor berichteten zu vergleichen.

Die von Symadex gebildeten Komplexe wurden unter den gleichen experimentellen Bedingungen untersucht wie die von C-1305 gebildeten Addukte, daher wurden die Zuordnungen der Resonanzen der ligandenfreien D2- und D3-Palindrome aus unserer vorherigen Studie übernommen13. Die Zuordnungen zu den Protonen der D2L- und D3L-Systeme sind in den Ergänzenden Daten aufgeführt (Tabelle S1, Abb. S4).

Eine gründliche Untersuchung der NOESY-Spektren (Abb. S1 und S2) ermöglichte bei beiden untersuchten Komplexen eine eindeutige Lokalisierung des Liganden zwischen T4- und A5-Einheiten. Dies war aufgrund umfangreicher Sätze der beobachteten DNA/C-1311-NOEs möglich, die in Tabelle 2 aufgeführt sind. Diese NOEs wurden später in Eingabeparameter für Molekulardynamikberechnungen (MD) übersetzt, wo sie als Abstandsbeschränkungen dienten. Die resultierenden MD-Trajektorien wurden schließlich einer Clusteranalyse unterzogen, um nach den repräsentativsten Strukturen jedes DNA/Liganden-Addukts zu suchen, die in Abb. 3 dargestellt sind.

(A) Die Struktur der 5′-ATAT-3′-Bindungshöhle mit eingebettetem Ligandenmolekül, dh dem zentralen Fragment des d(CGATATCG)2:C-1311 (D2L)-Komplexes. (B) Die Struktur der 5′-CTAG-3′-Bindungshöhle mit eingebettetem Ligandenmolekül, dh dem zentralen Fragment des d(CCCTAGGG)2:C-1311 (D3L)-Komplexes. Ausgewählte DNA/Ligand-NOEs wurden als rote, bidirektionale Pfeile zusammen mit den entsprechenden Zahlen dargestellt, die den in Tabelle 2 aufgeführten Korrelationen entsprechen.

Wie bereits berichtet11,12 interkalierte Symadex in die kleine Furche der dsDNA-Palindrome. Die Hydroxylgruppe des Liganden an Position 8 neigte dazu, eine Wasserstoffbrücke mit dem O4′-Sauerstoffatom zu bilden, das zur A5-Desoxyribose-Einheit eines der dsDNA-Stränge gehört, was die Stabilität des resultierenden Komplexes erhöhte. Diese Wasserstoffbindung bestand für 82,2 % der Simulationszeit im Fall des D2L-Addukts und für 85,3 % im Fall des D3L-Ensembles. Bemerkenswert ist, dass während der Simulationszeit die Aminoalkylseitenkette des Liganden, obwohl sie positiv geladen war, im Fall der beiden betrachteten Systeme keine besondere, bevorzugte Konformation innerhalb der kleinen Furche der DNA aufwies. Diese Beobachtung resultierte zwar aus den MD-Berechnungen, hatte jedoch tatsächlich eine solide spektroskopische Grundlage: In den NOESY-Spektren beider Komplexe wurden keine NOEs zwischen der Seitenkette von C-1311 und den Protonen der DNA aufgezeichnet (Tabelle 2). Dies war ein wesentlicher Unterschied im Vergleich zu früheren Studien zu C-1305, bei denen sich seine Seitenkette entlang des Zucker-Phosphat-Rückgrats der DNA ausrichtete und gelegentlich ihre Ausrichtung zwischen parallel und antiparallel zu einem bestimmten DNA-Strang wechselte. Diese Schlussfolgerungen wurden durch die beobachteten Seitenketten-/DNA-NOEs13 stark gestützt.

Unsere früheren Studien zu C-1305 haben gezeigt, dass die Sequenzspezifität der Bindung dieses Arzneimittels an dsDNA über Interkalation in Tetranukleotidschritten berücksichtigt werden sollte13. NMR-Bewertungen deuten darauf hin, dass die CTAG-Bindungsstelle gegenüber den GTAC- und ATAT-Sequenzen bevorzugt wurde, wohingegen die genauen Werte der Dissoziationskonstanten von C-1305 von verschiedenen NTAN-Stellen nicht ermittelt wurden13. Die Tetranukleotid-dsDNA-Spezifität wurde auch im Fall von C-1311 bestätigt, doch die aufgezeichneten NMR-Spektren deuten stark darauf hin, dass es diesbezüglich deutlich unterschiedliche Präferenzen gibt (ATAT > CTAG, GTAC). Um diese Präferenzen zu quantifizieren, dh in Form von Dissoziationskonstanten, haben wir vier zusätzliche palindromische DNA-Octamere, B1–B4, entworfen, die alle möglichen NTAN-Tetranukleotidschritte mit identischen flankierenden CG/CG-Basenpaaren enthalten (Tabelle 3).

Die DNA-Bindungsaffinität wurde mittels UV-VIS-Spektroskopie geschätzt. Eine gründliche chemometrische Analyse der resultierenden Spektren hat gezeigt, dass C-1311 zwar mit allen untersuchten Sequenzen interagierte, die Bindungsaffinitäten jedoch innerhalb des untersuchten Satzes von dsDNA-Oligomeren erheblich unterschiedlich waren. Die schwächste Bindung des Liganden, d. h. die höchste Dissoziationskonstante des Komplexes, wurde im Fall des Oktamers d(CGGTACCG)2 (B1) beobachtet, während seine Wechselwirkung mit d(CGCTAGCG)2 (B2) und (CGATATCG)2 ( B3)-Sequenzen waren relativ stark – obwohl die Dissoziationskonstante zu B3 deutlich niedriger war als die für B2 berechnete. Interessanterweise traten die stärksten DNA/Ligand-Wechselwirkungen im Fall des d(CGTTAACG)2 (B4)-Palindroms auf, der Wert der B4:C-1311-Dissoziationskonstante wurde jedoch lediglich ermittelt, da eine direkte Quantifizierung nicht möglich war . Um ein umfassenderes Bild zu zeichnen, haben wir schließlich auch die Bindungsaffinitäten von C-1305 in Gegenwart derselben vier B1–B4-Palindrome ermittelt (Tabelle 3), die sich – wie erwartet – im Vergleich zu deutlich anders herausstellten die für Symadex berechneten. Weitere Einzelheiten zu den durchgeführten UV-VIS-Studien und der chemometrischen Zerlegung der resultierenden Spektren finden Sie in den Zusatzdaten (Abb. S5–S9).

Darüber hinaus haben wir auch UV-VIS-Studien zu Nitroacridinen (C-283 und C-1748) durchgeführt, die mit kurzen dsDNA-Palindromen interagieren. Die Ergebnisse (Daten nicht gezeigt) haben die Behauptung, dass Nitracrin und C-1748 auf eher unspezifische Weise an DNA binden, stark gestützt. Die Dissoziationskonstanten konnten nicht bestimmt werden, da die Spektren der Liganden bei der Titration der DNA-Palindrome im Wesentlichen unverändert blieben.

Unter Berücksichtigung der für C-1305 und C-1311 erhaltenen Ergebnisse hinsichtlich ihrer Affinitäten zu den palindromischen NTAN-Tetranukleotidschritten ergibt sich das 5′-Pyrimidin-TA-Purin-3′ (5′-Pyr-TA-Pu-3′) Sequenzen scheinen im Vergleich zu den 5′-Pu-TA-Pyr-3′-Optionen im Allgemeinen bevorzugt zu sein. Unter den ersteren wurde der 5′-CTAG-3′-Tetranukleotidschritt als Kompromiss zwischen seiner Affinität zu Ligandenmolekülen und der einfachen Interpretation seiner NMR-Spektren angesehen. Obwohl das hier und in früheren Studien13 untersuchte palindromische Oktamer d(CCCTAGGG)2 (D3) eine CTAG-Sequenz enthält, enthält es auch CCC/GGG-Triaden, deren Zuordnung aufgrund der starken Überlagerung von Protonenresonanzen sehr kompliziert war. Letztendlich diente die D3-Sequenz zwar als guter Wirt für die Ligandenbindung, ihre spektroskopische Beschreibung war jedoch recht anspruchsvoll, insbesondere im ligandengebundenen Zustand. Daher haben wir das d(CGCTAGCG)2-Octamer (B2, siehe Tabelle 3) als potenziellen „goldenen Mittelwert“ untersucht und dabei seine Affinität zu Acridin-basierten Liganden und seine Zugänglichkeit im Hinblick auf 2D-NMR-Zuordnungen berücksichtigt.

Im Fall von C-1305 war der resultierende B2:Ligand-Komplex sehr gut definiert, während das Gleichgewicht zwischen freiem und gebundenem Zustand der DNA in Lösung deutlich in Richtung der Komplexbildung verschoben war (Abb. 4). 2D-NMR-Studien, die am d(CGCTAGCG)2:C-1305 (B2L)-Addukt durchgeführt wurden, haben bestätigt, dass sich ein einzelnes Ligandenmolekül genau im Zentrum des B2-Octamers interkaliert hat, was einen nichtkovalenten Komplex mit Konformationseigenschaften ergibt, die denen des Addukts sehr ähnlich sind diejenigen, über die zuvor berichtet wurde13. Dies war ein willkommenes und erwartetes Ergebnis; Weitere Einzelheiten zu dieser Struktur finden Sie in Abb. 5 und Tabelle 4 sowie in den Zusatzdaten (Tabellen S1 und S2, Abb. S4). Bemerkenswert ist, dass die Zuordnungen zu den Protonen des ligandengebundenen B2-Octamers (Abb. S3) im Vergleich zum D3-Duplex (Abb. S2) erheblich einfacher waren.

1H-NMR-Spektren von: freiem palindromischem Duplex d(CGCTAGCG)2, Codename B2 (A); B2-Duplex interagiert mit C-1311 (B) und B2-Duplex interagiert mit C-1305 (C). In allen Fällen betrug die Stöchiometrie der untersuchten Komplexe dsDNA/Ligand 1:1,5 mol/mol. Rote Sternchen markieren die Iminoprotonen der verbleibenden, freien dsDNA-Duplexe.

Die Struktur der 5′-CTAG-3′-Bindungshöhle mit eingebettetem Ligandenmolekül, dh dem zentralen Fragment des d(CGCTAGCG)2:C-1305 (B2L)-Komplexes. Ausgewählte DNA/Ligand-NOEs wurden als rote, bidirektionale Pfeile zusammen mit den entsprechenden Zahlen dargestellt, die den in Tabelle 4 aufgeführten Korrelationen entsprechen.

Im Gegenteil: Während die UV-VIS-Untersuchungen des B2:C-1311-Addukts eindeutig gezeigt haben, dass ein einzelner B2-Duplex erwartungsgemäß nur ein Symadex-Molekül enthielt (Abb. S9 und Tabelle 3), ergab die NMR-Untersuchung dieses Systems ein Ergebnis in den Spektren deutet darauf hin, dass sich der Komplex und die freie DNA tatsächlich in einem Gleichgewicht befanden, das ein Mediumaustauschregime aufwies (Abb. 4). Dies bedeutet, dass die Zeitskala der Bildung und Dissoziation des d(CGCTAGCG)2:C-1311-Addukts chemische Verschiebungsunterschiede zwischen dem gebundenen und dem freien Zustand darstellte, was ein gemitteltes Bild ergab, das aus stark verbreiterten Resonanzen bestand. Letztendlich wurde das B2:C-1311-System keinen umfangreichen 2D-NMR-Experimenten unterzogen, da die Änderung der Gesamtkonzentration und der relativen Konzentrationen von B2-Palindrom und Symadex das resultierende 1H-NMR-Bild nicht verbesserte.

Vier unsymmetrische Bisacridine (UAs): C-2028, C-2041, C-2045 und C-2053 wurden in Gegenwart speziell entwickelter, längerer palindromischer Sequenzen getestet, die TA/TA- oder TG/CA-Dinukleotidschritte näher an den Enden von enthielten die DNA-Duplexe (U1–U4, Tabelle S3). Während dieser Experimente interkalierten die UAs überhaupt nicht in die oben genannten dsDNA-Oligomere. Die resultierenden 1H-NMR-Spektren von dsDNA:UA-Komplexen waren denen von Nitroacridin-Monomeren sehr ähnlich (Abb. 6, siehe auch Abb. 2), was auf unspezifische DNA/Ligand-Wechselwirkungen schließen lässt, vermutlich in einer kleinen Furche einer Helix. Diese Beobachtung bestätigte unsere früheren Einschätzungen und zeigte, dass UAs keinen nennenswerten Einfluss auf die dsDNA-Schmelzpunkte hatten1. Die Ursache dieses auf den ersten Blick unerwarteten Verhaltens unsymmetrischer Bisacridine bedarf einer eingehenden Diskussion.

1H-NMR-Spektren von: freiem palindromischem Duplex d(CGTAGCTACG)2, Codename U2 (A); U2-Duplex interagiert mit C-2045 (B). In allen Fällen betrug die Stöchiometrie der untersuchten Komplexe dsDNA/Ligand 1:1,5 mol/mol. Rote Sternchen markieren die Iminoprotonen der verbleibenden, freien dsDNA-Duplexe. Das U2 wurde nicht mittels 2D-NMR-Spektroskopie analysiert, daher wurden die Iminoprotonen nicht markiert.

In dieser Studie haben wir bestätigt, dass Imidazoacridinon C-1311 (Symadex) ein wirksamer dsDNA-Interkalator auf Acridinbasis ist, der die 5′-NTAN-3′-Tetranukleotidsequenz als Bindungsstelle auswählt, sofern verfügbar. Der Interkalationsprozess findet in der kleinen Furche der dsDNA-Helix statt, was auf das Vorhandensein einer positiv geladenen Aminoalkyl-Seitenkette zurückzuführen ist, die vermutlich als molekularer Anker dient und eine Affinität zum polyanionischen Zuckerphosphat-Rückgrat der DNA-Stränge aufweist. Die 8-Hydroxylgruppe von C-1311 (Abb. 1) ist ein zusätzliches Strukturelement, das den resultierenden Komplex stabilisiert, da sie eine Wasserstoffbrücke mit dem O4′-Atom der einen der Desoxyribose-Einheiten bilden kann. Die gebildeten nichtkovalenten DNA:C-1311-Addukte sind relativ stabil, obwohl sie – wie unsere Experimente gezeigt haben – eine andere Stabilität und spektroskopische Eigenschaften im Vergleich zu den Komplexen aufweisen, die durch C-1311s Triazoloacridinon-Cousin, also C-1305, gebildet werden. Einer der Hauptgründe für die bemerkenswerte Ungleichheit der Bindungsaffinitäten an dsDNA zwischen diesen beiden sehr ähnlichen Verbindungen muss in einem großen strukturellen Unterschied liegen, den sie aufweisen, nämlich der Struktur einer Aminoalkyl-Seitenkette.

Die NOESY-Spektren der verschiedenen zu diesem Zweck untersuchten DNA:C-1305-Komplexe zeigten stets NOE-Kontakte zwischen den Protonen der Seitenkette des Liganden und den Protonen der DNA. Diese Tatsache weist eindeutig darauf hin, dass die Aminoalkyleinheit von C-1305 einige Konformationspräferenzen aufwies, dh sie neigte dazu, sich entlang des Zucker-Phosphat-Rückgrats eines DNA-Strangs auszurichten. Im Gegenteil, bei den spektroskopischen Untersuchungen der DNA:C-1311-Addukte wurden keine ähnlichen NOEs beobachtet. Daher wurde der Schluss gezogen, dass die Aminoalkylseitenkette von Symadex keine bevorzugten Ausrichtungen innerhalb einer kleinen Furche der DNA-Duplexe aufwies. Dieses Ergebnis wurde durch die Molekularmodellierungsrechnungen der untersuchten Systeme zusätzlich untermauert. Während im Fall von C-1305 die Aminoalkyleinheit während des größten Teils der Simulationszeit eindeutig in einer Weise ausgerichtet war, wie es die Spektren vermuten ließen, wies die Seitenkette von C-1311 keine Konformationsagenda auf. Die Ursache dieser Unterschiede liegt in der Struktur beider Einheiten. Die Seitenkette von C-1305 besteht aus n-Propyl und zwei Methylgruppen, die an ein tertiäres Stickstoffatom gebunden sind, das unter den experimentellen Bedingungen positiv geladen ist, während die Einheit von C-1311 aus drei Ethylgruppen besteht, die an ein ähnliches Stickstoffatom gebunden sind. Während Ersteres wesentlich flexibler ist, ist Letzteres weitaus sterisch gehinderter. Darüber hinaus hat die positive Ladung in der Seitenkette von Symadex angesichts der Position der Stickstoffatome eine geringere Reichweite, was nach der Interkalation wirksame elektrostatische Wechselwirkungen mit dem polyanionischen DNA-Rückgrat verhindert. Unterdessen hat die positive Ladung der Aminoalkyleinheit von C-1305 sowohl eine größere Reichweite als auch eine größere Konformationsfreiheit, was es ihr ermöglicht, als zweiter Anker zu fungieren, während sie an die DNA gebunden ist. Der erste Anker ist die 8-OH-O4′-Wasserstoffbindung der oben genannten Liganden innerhalb der Interkalationsstelle. Obwohl sowohl C-1305 als auch C-1311 in der Lage sind, den Wasserstoffbrückenanker nach dem Interkalationsereignis zu nutzen, wird letzterem effektiv der zweite Anker entzogen, der durch die Wechselwirkungen der Seitenkette aufgebaut wird. Dieser Seitenkettenanker verleiht dem resultierenden nichtkovalenten dsDNA:C-1305-Addukt zusätzliche Stabilität. Im Fall von Symadex spielt die positiv geladene Seitenkette vermutlich nur im möglichen (noch nicht experimentell nachgewiesenen) Vorinterkalationsstadium eine wichtige Ankerrolle und hilft bei der Ansiedlung des Liganden in einer kleinen Furche der dsDNA. Obwohl sowohl C-1305 als auch C-1311 sehr wirksame Interkalatoren sind, ist ersterer aufgrund des Vorhandenseins eines zusätzlichen stabilisierenden Faktors in der Lage, weniger dynamische Komplexe zu erzeugen als letzterer.

Unter Berücksichtigung der in Tabelle 3 dargestellten Daten ist es sicher, dass die Wechselwirkungen zwischen dem dsDNA-Rückgrat und der Seitenkette des Liganden zu den beobachteten Dissoziationskonstanten beitragen. Es ist jedoch auch ziemlich klar, dass der zweite Faktor, der zur Stärke der Wechselwirkungen zwischen DNA und Ligand beiträgt, der ist Struktur des Ringsystems des Liganden, da C-1305 und C-1311 etwas unterschiedliche elektronische Strukturen ihrer aromatischen Einheiten aufweisen (Abb. 1). Man könnte daraus schließen, dass C-1305 im Allgemeinen strukturell weniger dynamische Komplexe zu bilden scheint, während C-1311 ein etwas stärkeres Bindemittel ist. Allerdings hängen die Dissoziationskonstanten der beiden Liganden auch stark von der gebundenen dsDNA-Sequenz ab, was manchmal zu inversen Ergebnissen führt. Beispielsweise bindet C-1305 deutlich stärker an die B1-Sequenz als C-1311, wohingegen im Fall der B3-Sequenz die Beziehung zwischen C-1305 und C-1311 im Idealfall umgekehrt ist, während sie im Vergleich zu den für B1 ermittelten Dissoziationskonstanten ( Tisch 3). Obwohl wir also die strukturelle Dynamik eines Komplexes mit der Struktur der Seitenkette in Verbindung bringen können, können wir die DNA/Ligand-Dissoziationskonstanten tatsächlich nicht ausschließlich mit der Struktur der Seitenkette eines Liganden in Verbindung bringen, da es sich um ein Zusammenspiel von drei Faktoren handelt: der Struktur der Seitenkette, der Struktur des Ringsystems des Liganden und die Struktur des Bindungshohlraums, also der DNA-Wirtssequenz.

Obwohl zahlreiche Referenzen darauf hindeuten, dass Nitracrin (C-283) und – in gewisser Weise – sein Analogon C-1748 effiziente dsDNA-Interkalatoren sind7,8,9,10,19,20,21,22, haben unsere Untersuchungen diese Behauptungen nicht bewiesen . Nitroacridine basieren strukturell auf Acridin, einem gut etablierten dsDNA-Interkalationsmittel23,24, daher schien die Annahme über ihre interkalierende Wirkungsweise sehr vernünftig. Die experimentelle Unterstützung dieser Behauptung basierte jedoch auf Untersuchungen an längeren Fragmenten verdauter zellulärer DNA, die mit Nitroacridinen interagierten. Die erhaltenen Daten wiesen ganz indirekt auf die Möglichkeit einer Interkalation hin, d. h. der Schmelzpunkt der dsDNA wurde in Gegenwart von Nitroacridinen leicht erhöht21, während das Nitracrin und seine Analoga die Entwindung der Supercoiling-DNA und die Umkehrung des Supercoilings induzierten, was ein charakteristisches Merkmal ist von Interkalationsmitteln22. Bemerkenswerterweise zeigten 3-Nitroacridine im Vergleich zu den 1-Nitroacridinen, also C-283 (Nitracrine)21, stärkere Wechselwirkungen mit dsDNA. Nach der metabolischen Aktivierung des Arzneimittels, die mit der Reduktion der 1-Nitro-Einheit verbunden war, konnte eine viel ausgeprägtere dsDNA:Nitracrin-Bindungsaffinität beobachtet werden25,26. Vermutlich führte dies zur Bildung kovalenter DNA/Ligand-Bindungen und zur DNA-Vernetzung9,10.

Letztendlich konnten wir bei unseren Untersuchungen weder für C-283 noch für C-1748 ein einziges Interkalationsereignis nachweisen, während wir mehrere palindromische Oktamere untersuchten. Sogar der TA/TA-Schritt, der angesichts der Stapelenergien der am einfachsten zu „einsteigende“ aller zehn möglichen Dinukleotidschritte27,28 ist, war offenbar nicht einladend genug, um mit einem der besprochenen Nitroacridine einen stabilen Interkalationskomplex zu bilden. Obwohl wir einige dsDNA/Nitroacridin-Wechselwirkungen beobachtet haben, unterschieden sich die resultierenden Bilder erheblich von denen, die von C-1305 und C-1311 erzeugt wurden. Für diese Monoacridine zeigten die Spektren ihrer Komplexe Resonanzen sowohl von freier DNA als auch von komplexen Spezies, was auf den langsamen Austausch der resultierenden Addukte mit freier DNA hindeutet und die Beobachtung von DNA/Ligand-NOE-Kontakten ermöglicht. Im Fall von C-283 und C-1748 zeigten die Spektren nur einen Satz von DNA-Resonanzen, wohingegen die Ligandenresonanzen überhaupt nicht beobachtet werden konnten. Obwohl die DNA:Ligand-Spektren tatsächlich die Vorliebe der Nitroacridine zeigten, sich im Zentrum eines untersuchten D2-dsDNA-Duplexes anzuordnen, konnten die aufgezeichneten Protonenresonanzen keinen Interkalationsmodus der Bindung weder von Nitracrin noch von dessen C-Bindung nachweisen. 1748 analog. Unsere Interpretation der aufgezeichneten Spektren geht von der nicht-interkalierenden Minor-Groove-Methode der DNA-Bindung beider Moleküle aus, es muss jedoch festgestellt werden, dass wir die Möglichkeit einer Interkalation nicht ausschließen können, da sie im Vergleich zu eine um Größenordnungen höhere dsDNA:Ligand-Dissoziationskonstante aufweist C-1305 oder C-1311. Bemerkenswerterweise war die Affinität von C-283 (Nitracrine) zu einer bestimmten dsDNA-Sequenz erheblich höher als die von C-1748. Man könnte diese Beobachtung vielleicht – wiederum – mit der Struktur der Seitenketten der beiden Nitroacridine in Verbindung bringen. In einem Satz heißt es, dass die Seitenkette von Nitracrine länger ist und unter den gegebenen Versuchsbedingungen positiv geladen war, wohingegen die Seitenkette von C-1748 kürzer ist und mit einer Hydroxylgruppe endet und daher in derselben Umgebung ungeladen war (Abb. 7).

Die Deprotonierung des Stickstoffatoms, eingebettet in das Acridin-Ringsystem. Bei einem pH-Wert unter 7 ist der Stickstoff in der R2-Einheit von C-283 protoniert und positiv geladen.

Die Hauptursache für dieses scheinbar unerwartete Verhalten von Nitroacridinen liegt möglicherweise in der Struktur der Ringsysteme beider Verbindungen. Der erste Grund für diese scheinbare Interkalationsmeuterei ist die Tatsache, dass diese Strukturen, also C-283 und C-1748, nicht flach sind. Die an das Ringsystem gebundene 9-Aminogruppe ist tatsächlich eine Iminogruppe, während sich das Proton – das ursprünglich für die 9-Aminogruppe vorgesehen war – am im Ringsystem eingebetteten Stickstoffatom befindet, was eindeutig nachgewiesen wurde durch unsere früheren NMR-Studien6 (Abb. 7). Dies führt zu zwei separaten, aromatischen Ringen vom Benzoltyp innerhalb der Struktur, während das gesamte System leicht in die Form eines Schmetterlings gebogen ist, was zum ersten Mal bei den kristallographischen Untersuchungen an Nitracrine29 sichtbar wurde. Darüber hinaus befinden sich die Sauerstoffatome der 1-Nitro-Einheit auch nicht innerhalb der Ebene des angehängten aromatischen Rings. Die –NO2-Gruppe ist deutlich verdreht, was die ohnehin nicht flache Geometrie des Ringsystems zusätzlich stört. Infolgedessen könnten die DNA/Liganden-Stapelenergien, von denen erwartet wird, dass sie zur Stabilität eines resultierenden Komplexes beitragen, im Fall von Nitroacridinen einfach zu niedrig sein, um eine Öffnung innerhalb der DNA zu erzwingen. Selbst wenn die Öffnung erzeugt wird, scheint der resultierende DNA:Nitroacridin-Interkalationskomplex sehr instabil zu sein. Daher wird die Bindung an die kleine Furche eines DNA-Duplex als die vernünftigste Art der Wechselwirkung vorgeschlagen, die das dsDNA:Nitroacridin-System zumindest bei pH ~ 6,0 und darunter ermöglichen kann, ist aber nicht eindeutig bewiesen. Unter leicht basischen Bedingungen wird das Ringsystem von Nitroacridinen negativ geladen, was zu einer deutlich verringerten Affinität zu Nukleinsäuren führt (Abb. 7).

Wie bereits erwähnt, bestehen die unsymmetrischen Bisacridine (UAs) aus zwei Ringsystemen auf Acridinbasis (Abb. 1). Da einer von ihnen mit dem Ringsystem von C-1311 identisch ist und wenn man bedenkt, dass C-1311 ein recht wirksames Interkalationsmittel ist, könnte man davon ausgehen, dass die UAs in der Lage sein sollten, zumindest „teilweise“ Interkalationskomplexe zu bilden Dabei ist zu berücksichtigen, dass das zweite Ringsystem eine Kopie von vermutlich nicht interkalierendem (oder möglicherweise instabilen Interkalationskomplexen erzeugendem) Nitracrin oder C-1748 ist. Letzteres sollte in der Lage sein, sich irgendwo in einer kleinen Furche der dsDNA zu lokalisieren, was zu einer interessanten Art der Bindung von UAs an DNA-Duplexe führen würde: halb Interkalation (über die C-1311-Einheit), halb Bindung in der kleinen Furche (über den Linker). und Nitroacridin-Anteil). Unsere NMR-Studien haben bewiesen, dass dieses Konzept völlig falsch ist. Während die UAs theoretisch tatsächlich wie perfekte Bis-Interkalatoren aussehen, sind sie in Wirklichkeit nicht einmal Halb-Interkalatoren, da sich herausstellte, dass die Anwesenheit der aromatischen Einheit eines C-1311 nicht ausreicht, um eine Interkalation zu erzwingen Modus für die Bindung von UAs in doppelsträngige DNA.

Unter Berücksichtigung der oben für Symadex und die Nitroacridine, einschließlich Nitracrine, diskutierten Aspekte ist es schließlich viel einfacher zu erklären, warum unsymmetrische Bisacridine (UAs) nicht als dsDNA-Interkalatoren wirken. Der Vergleich von C-1305 und C-1311 hat die große Rolle einer Aminoalkyl-Seitenkette bei der Bildung des dsDNA:Ligand-Komplexes und seiner weiteren Stabilisierung hervorgehoben. Im Fall von UAs sollten hinsichtlich der möglichen Interkalation der Linker und die Nitroacridin-Einheit als riesige Seitenkette betrachtet werden, die an das Imidazoacridinon-Ringsystem gebunden ist. Diese „Seitenkette“, obwohl positiv geladen, könnte entweder zu groß sein, um spezifisch mit dem Zucker-Phosphat-Rückgrat der DNA-Stränge zu interagieren, oder ihre Struktur könnte diese Wechselwirkungen einfach ungünstig machen. Daher dient die Seitenkette in dieser Version der Geschichte als destabilisierendes Mittel nach einem möglichen Interkalationsereignis. Alternativ können die Wechselwirkungen der Seitenkette innerhalb der kleinen Furche der DNA wirksam verhindern, dass die angehängte C-1311-Einheit interkaliert. Unabhängig davon, welche der obigen Aussagen wahr ist – vielleicht sind sie teilweise alle wahr –, ist der Effekt derselbe: Ein Interkalationsereignis des UA-Moleküls in die dsDNA wird in keinem Fall beobachtet. Dennoch sollte beachtet werden, dass der Austausch der Nitroacridin-Einheit in ein C-1305-Ringsystem möglicherweise zur Bildung eines wirksamen UA-Bi-Interkalators führen könnte; Weitere Studien zu diesem Thema sind in Vorbereitung.

Doppelsträngige DNA ist nur eine von mehreren Formen, die Desoxyribonukleinsäuren annehmen können. Letztendlich kann das Fehlen von dsDNA/UAs-Wechselwirkungen, was dazu führt, dass UAs keinen Einfluss auf die dsDNA-Struktur und -Funktion in einer Zellumgebung haben, in einigen pharmakologischen Szenarien als Vorteil angesehen werden. Andererseits deuten unsere vorläufigen NMR-Studien stark darauf hin, dass sowohl C-1311 als auch UAs wohldefinierte Wechselwirkungen mit mehreren DNA-G-Quadruplexen aufweisen, die derzeit als sehr attraktive molekulare Ziele in der Krebstherapie gelten. Diese Ergebnisse stimmen perfekt mit unseren früheren Berichten überein, die zeigten, dass UAs die Expression von K-Ras in Panc-1-Zellen1 sowie von c-Myc in H460-Zellen30 hemmen. Fortgeschrittene NMR-Studien zu den resultierenden G4/UA-Komplexen und die Auswirkungen ihrer Bildung werden in unserer zukünftigen Arbeit diskutiert.

5-Diethylaminoethylamino-8-hydroxyimidazoacridinon (C-1311, Symadex), 5-[[3-(dimethylamino)propyl]amino]-8-hydroxy-6H-v-triazolo[4,5,1-de]acridin-6 -on (C-1305), 9-(2′-hydroxyethylamino)-4-methyl-1-nitroacridin, (C-1748), 1-nitro-9-[3′-(dimethylamino)propylamino]acridin (C- 283, Ledakrin/Nitracrine), 9-{N-[(imidazo[4,5,1-de]-acridin-6-on-5-yl)aminopropyl]-N-methylaminopropylamino}-1′-nitroacridin × 1,5HCl (C-2028), 1-[3-(imidazo[4,5,1-de]-acridin-6-on-5-yl)aminopropyl]-4-[3′-(1′-nitroacridin-1- yl)-aminopropyl]piperazin × 4HCl (C-2041), 9-{N-[(8-hydroxyimidazo[4,5,1-de]-acridin-6-on-5-yl)aminopropyl]-N-methylaminopropylamino }-4′-Methyl-1′-nitroacridin × 3HCl (C-2045), 9-{N-[(imidazo[4,5,1-de]-acridin-6-on-5-yl)aminopropyl]- N-Methylaminopropylamino}-4′-methyl-1′-nitroacridin × 3HCl (C-2053) wurde am Institut für Pharmazeutische Technologie und Biochemie der Fakultät für Chemie der Technischen Universität Danzig synthetisiert. Alle DNA-Sequenzen wurden von Metabion, GmbH erworben und zusätzlich mit Amicon Ultra 2-ml-Zentrifugalfiltern von Merck gereinigt. Dieser Prozess diente der Entfernung einer Verunreinigung, die zu sehr starken Signalen in den Protonen-NMR-Spektren bei etwa 1,28, 1,99, 3,21 und 8,60 ppm führte (Triethylaminacetat, vom Oligolieferanten während der HPLC-Reinigung verwendet).

Jedes in dieser Studie verwendete Oligo war vollständig selbstkomplementär und daher bestand die Herstellung der Duplexproben einfach aus dem Auflösen des gereinigten Materials in einem geeigneten Puffer. Die optimalen experimentellen Bedingungen, die die Neigung von Monoacridinen und unsymmetrischen Bisacridinen (UAs) zur Selbstassoziation verringern und gleichzeitig helikale Formen kurzer dsDNA-Oligomere beibehalten, wurden als 2,5 mM Cacodylatpuffer mit einem pH-Wert von 5,0 und 10 mM NaCl ausgewählt. Um die Proben der dsDNA:Ligand-Interkalationskomplexe vorzubereiten, wurde der Ligand (Monoacridin/UA, siehe Abb. 1) aus einer konzentrierten Stammlösung in Wasser zu der vorgemischten NMR-Probe gegeben, um das molare Verhältnis von Duplex:Ligand zu erreichen 0,5, 1,0, 1,25 oder 2,0, je nach Probe. Die Titrationsexperimente wurden durch schrittweise Zugabe der konzentrierten Stammlösungen von C-283 oder C-1748 zu einer DNA-Probe durchgeführt; Ein einzelner Ligandenanteil entsprach dem 0,1-molaren Äquivalent des DNA-Host-Duplexes.

Alle NMR-Spektren wurden mit einem 700 MHz Bruker Avance III HD-Spektrometer gesammelt, das mit einer QCI CryoProbe ausgestattet war. Nachdem drei 8-bp-DNA-Duplexe identifiziert wurden, die einen einzelnen, wohldefinierten Komplex mit C-1305 oder C-1311 bilden (D2, D3, B2 – siehe „Ergebnisse“), wurde für jeden von ihnen ein Satz 2D-Spektren zur Resonanzzuordnung aufgezeichnet die freien Maisonetten. Es umfasste die NOESY-Spektren (150 ms Mischzeit) und TOCSY-Spektren (60 ms Spin-Lock-Zeit), gemessen bei 5 °C in 90 % H2O/10 % D2O, sowie die NOESY-Spektren (150 und 400 ms Mischzeit). HC-HSQC-, HP-COSY- und DQF-COSY-Spektren, aufgenommen in 100 % D2O bei 5 °C. Der Resonanzzuordnungsprozess selbst wurde unter Verwendung von Standardansätzen31 durchgeführt. Zur Zuordnung der dsDNA/Ligand-Komplexe und zur Identifizierung der DNA-Ligand-Kreuzpeaks wurden für die Komplexe die NOESY- (150 ms Mischzeit), TOCSY- (60 ms Spin-Lock-Zeit) und HC-HSQC-Spektren aufgenommen bei 5 °C, sowohl in 90 % H2O/10 % D2O als auch in 100 % D2O.

Molekulardynamiksimulationen (MD) wurden für die Interkalationskomplexe d(CGATATCG)2:C-1311, d(CCCTAGGG)2:C-1311 und d(CGCTAGCG)2:C-1305 durchgeführt, die explizit in kubischen Kästen solvatisiert wurden, mit ~ 5500 TIP3P-Wassermoleküle bei einer NaCl-Konzentration von 0,01 M. Die Kraftfeldparameter für die DNA-Octamere wurden der neuesten Iteration des CHARMM36-Nukleinsäure-Kraftfelds32 entnommen. Die Parameter für C-1305 und C-1311 wurden der neuesten Version von CHARMM36 Generalized Force Field (CGenFF)33 entnommen; Die partiellen Atomladungen des Liganden wurden von Anfang an mit der GAUSSIAN09-Software34 auf der MP2/6-31G*-Theorieebene berechnet. Alle Energieminimierungen und MD-Simulationen wurden mit GROMACS 2020.435 durchgeführt. Alle MD-Simulationen wurden mit dem Leapfrog-Schema mit einem Zeitschritt von 2 fs durchgeführt. Die Partikelnetz-Ewald-Technik mit einem Cutoff von 1 nm und einem Gitterabstand von ca. 0,1 nm wurden zur Bewertung der elektrostatischen Kräfte36 verwendet. Die Van-der-Waals-Wechselwirkungen wurden unter Verwendung des Lennard-Jones-Potentials mit einem Cutoff von 1 nm berechnet. Die Simulationen wurden bei einer konstanten Temperatur von 278 K und einem konstanten Druck von 1 bar unter Verwendung der Methode der schwachen Kopplung37 durchgeführt.

Nachdem die anfängliche B-Form von DNA-Duplexen aus X3DNA 2.338 erhalten wurde, wurde ein C-1305- oder C-1311-Molekül mit einem protonierten tertiären Stickstoff am Ende der Seitenkette mithilfe der VMD-Software in mäßiger Nähe zu einem entsprechenden DNA-Duplex platziert39. Nach der entsprechenden Energieminimierung und 100 ns MD-basierter anfänglicher Äquilibrierung mit Positionsbeschränkungen für DNA und Ligandenmolekül wurde jedes System 1 ns lang simuliert. Während dieses Laufs wurden Abstandsbeschränkungen angewendet, die den NOE-Kontakten zwischen den aromatischen Protonen des Liganden und den Protonen der DNA entsprachen (Tabellen 2 und 4). Dies erfolgte mithilfe der GROMACS-Implementierung des Beschränkungspotenzials, die dem Potenzial einen quadratischen Abzug hinzufügt, wenn ein Abstand einen unteren oder oberen Schwellenwert überschreitet (siehe Tabelle S4 in den ergänzenden Daten). Die gleichen Kraftkonstanten von 1000 kJ mol−1 nm−2 wurden für alle eingeschränkten Abstände verwendet, die intermolekularen DNA/Ligand-Kontakten entsprechen. Die oben beschriebenen Simulationen führten zu einer DR-gesteuerten Interkalation von Ligandenmolekülen aus der kleinen Furche von DNA-Duplexen in die 5′-TA-3′/5′-TA-3′-Stelle. Anschließend wurde der endgültige Frame aus jeder resultierenden Flugbahn extrahiert. Diese Frames wurden als Ausgangspunkte für die unten beschriebenen 1 µs langen MD-Simulationen festgelegt, denen eine 100 ns lange weitere Äquilibrierung mit Positionsbeschränkungen für DNA- und Ligandenmoleküle vorausging.

Während dieses Laufs wurden die Systeme 19 (D2L und D3L) und 23 (B2L) Abstandsbeschränkungen unterzogen, die aus dem NOESY-Experiment von τm = 150 ms abgeleitet wurden, sowie weiteren 14 (D2L) und 16 (D3L, B2L) Abstandsbeschränkungen, wodurch die Wasserstoffbrückenbindungen in Watson-Crick-Basenpaaren. Mit Ausnahme der terminalen G≡C-Paare waren alle Basenpaare stabilisiert, da die G8-Iminoprotonenresonanz in den 1H-NMR-Spektren keines der untersuchten Komplexe beobachtet wurde. Die Abstandshaltekraftkonstante betrug ebenfalls 1000 kJ mol−1 nm−2.

Die Clusteranalyse wurde mit der Daura-Methode40 mit einem RMSD-Grenzwert von 0,2 nm durchgeführt.

Es wurden 0,01 mM Lösungen von C-1311 und C-1305 hergestellt und die DNA-Lösungen portionsweise zugegeben, um die folgenden Verhältnisse zu erhalten: 0,25, 0,5, 1, 1,5, 2, 3, 5, 7 DNA in Bezug auf C-1311 und C-1305. Die Konzentration des Liganden wurde konstant gehalten. Nach jeder Zugabe wurden UV-VIS-Spektren in einer Quarzküvette mit einer optischen Weglänge von 1 cm gesammelt.

Alle Spektrensätze wurden in Matrizen organisiert und zentriert. Anschließend wurden die Datenmatrizen mithilfe des PCA-Algorithmus (Double Principal Component Analysis) numerisch in Eigenvektoren zerlegt. Zur Erstellung von Scatchard-Diagrammen wurden Stoffmengenanteile bestimmter Formen verwendet, die auf der Grundlage ausgewählter Eigenvektoren berechnet wurden. Dissoziationskonstanten wurden auf der Grundlage des Scatchard-Diagramms durch stückweise Regression bestimmt.

Das Scatchard-Diagramm wurde als Funktion von ν/L gegen v ausgedrückt. Solange v gleich n war (Anzahl identischer und unabhängiger Bindungsstellen); n, L und M wurden aus zuvor bestimmten Stoffmengenanteilen gemäß Gl. berechnet. (1):

wobei: v – durchschnittliche Belegung des DNA-Wirts durch Ligandenmoleküle; M – Gesamtkonzentration der DNA; c – Gesamtligandenkonzentration; L – Konzentration des freien Liganden.

Die meisten der während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel (und seinen ergänzenden Datendateien) enthalten. Die vollständigen 2D-NMR-Spektren und MD-Trajektorien, die während der aktuellen Studie generiert und analysiert wurden, sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Die Autoren danken Professor Jan Mazerski (Abteilung für Pharmazeutische Technologie und Biochemie, Fakultät für Chemie, Technische Universität Danzig, Danzig, Polen) für seine Unterstützung und wesentliche Hilfe bei chemometrischen Analysen. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium des Polnischen Nationalen Wissenschaftszentrums Nr. finanziert. 2019/33/B/NZ7/02534. Finanzielle Unterstützung erhielten wir auch durch ein Stipendium des Polnischen Nationalen Wissenschaftszentrums Nr. 2017/01/X/NZ7/00752. Diese Forschung wurde teilweise von der PLGrid-Infrastruktur unterstützt. Rechenressourcen wurden auch von TASK (Danzig) bereitgestellt.

Abteilung für Pharmazeutische Technologie und Biochemie und BioTechMed-Zentrum, Fakultät für Chemie, Technische Universität Danzig, Gabriela Narutowicza Str. 11/12, 80-233, Danzig, Polen

Tomasz Laskowski, Michał Kosno, Joanna E. Frackowiak, Julia Borzyszkowska-Bukowska, Paweł Szczeblewski, Nikola Radoń, Maria Świerżewska, Ewa Paluszkiewicz und Zofia Mazerska

Institut für Bioorganische Chemie, Polnische Akademie der Wissenschaften, Zygmunta Noskowski Str. 12/14, 61-704, Posen, Polen

Witold Andrałojć

Fakultät für Angewandte Physik und Mathematik, Technische Universität Danzig, Gabriela Narutowicza Str. 11/12, 80-233, Danzig, Polen

Anna Woźny

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TL und MK konzipierten die Experimente, TL, MK, WA und JEF führten die Experimente durch, TL, MK, WA, JB-B., PS, NR, M.Ś. und AW analysierten die Ergebnisse, EP synthetisierte die untersuchten Verbindungen, TL, MK, WA, JEF und ZM verfassten das Hauptmanuskript, TL bereitete die Abbildungen vor. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7. Alle Autoren haben das Manuskript rezensiert.

Korrespondenz mit Tomasz Laskowski.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Laskowski, T., Kosno, M., Andrałojć, W. et al. Die Wechselwirkungen von monomeren Acridinen und unsymmetrischen Bisacridinen (UAs) mit DNA-Duplexen: eine Erkenntnis aus NMR- und MD-Studien. Sci Rep 13, 3431 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-30587-y

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Eingegangen: 02. Dezember 2022

Angenommen: 27. Februar 2023

Veröffentlicht: 01. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-30587-y

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Die Wechselwirkungen von monomeren Acridinen und unsymmetrischen Bisacridinen (UAs) mit DNA-Duplexen: eine Erkenntnis aus NMR- und MD-Studien